Metodo enzimatico Sanger.
Ciao ragazzi! Qualche anima pia potrebbe spiegarmi il metodo enzimatico Sanger per sequenziare il dna? Non mi è molto chiaro purtroppo. Grazie a chi risponderà!
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Per capire il metodo di sequenziamento Sanger devi avere ben presente come avviene la replicazione del DNA in condizioni "normali": l'enzima DNA polimerasi catalizza la reazione di formazione di un legame fosfodiestere tra un nucleotide e quello successivo utilizzando uno dei due filamenti di DNA come "stampo" ("legge" la base azotata sul filamento "stampo" e attacca il nucleotide con la base azotata complementare sul filamento "nascente", secondo la regola di accoppiamento A-T e G-C). Il legame tra i due nucleotidi avviene perchè il nucleotide precedente presenta un gruppo OH in posizione 3' dello zucchero desossirobosio. Se manca questo gruppo, NON si può formare il legame con il nucleotide successivo e quindi la reazione di polimerizzazione si blocca.
Il metodo di sequenziamento Sanger si basa infatti sull'utilizzo di nucleotidi modificati (dideossitrifosfato, ddNTPs), privi del gruppo OH in posizione 3', per interrompere la reazione di sintesi in posizioni specifiche.
Nel metodo Sanger vengono eseguite 4 reazioni di polimerizzazione separate, in ognuna delle quali sono presenti il DNA da sequenziare (che fornisce il filamento "stampo" ), un primer (pezzetto di DNA che serve per iniziare la reazione), l'enzima DNA polimerasi, tutti e 4 i nucleotidi "normali" (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) e in ognuna delle 4 reazione viene aggiunto uno dei quattro nucleotidi "modificati" (ddATP nella prima, ddCTP nella seconda, ddGTP nella terza, ddTTP nella quarta).
Perciò quello che succede in ogni reazione è che durante la replicazione del DNA, in maniera casuale, ogni tanto viene incorporato il nucleotide modificato, interrompendo la reazione.
Quindi, ad esempio, nella reazione contenente ddATP otteniamo:
filamento stampo
CCGTTAGCTAGAATTTCGATTAGCT
filamenti nascenti (complementari a quello stampo)
GGCA --> interrotto alla prima T
GGCAA --> interrotto alla seconda T
GGCAATCGA --> interrotto alla terza T
e così via.
Ottieni quindi frammenti di DNA di lunghezza diversa, tutti interrotti con una Adenina (ddATP, modificata), e così per ognuna delle 4 reazioni allestite, solo che ognuna avrà frammenti che terminano con un nucleotide diverso.
A questo punto i frammenti di DNA ottenuti da ciascuna reazione vengono fatti correre in un gel e separati in base alla lunghezza (proporzionale al peso molecolare) mediante la tecnica dell'elettroforesi.
Si ottengono 4 colonne corrispondenti ai frammenti delle 4 reazioni; ogni frammenti occupa un'altezza diversa sul gel che corrisponde alla sua lunghezza. Dall'ordine con cui si alternano i frammenti provenienti da ciascuna delle 4 reazioni si ottiene la sequenza nucleotidica del DNA sequenziato.
Guarda il disegno che ho caricato e se ancora hai dei dubbi, prova a fare una domanda più specifica e io cercherò di aiutarti :)
Il metodo di sequenziamento Sanger si basa infatti sull'utilizzo di nucleotidi modificati (dideossitrifosfato, ddNTPs), privi del gruppo OH in posizione 3', per interrompere la reazione di sintesi in posizioni specifiche.
Nel metodo Sanger vengono eseguite 4 reazioni di polimerizzazione separate, in ognuna delle quali sono presenti il DNA da sequenziare (che fornisce il filamento "stampo" ), un primer (pezzetto di DNA che serve per iniziare la reazione), l'enzima DNA polimerasi, tutti e 4 i nucleotidi "normali" (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) e in ognuna delle 4 reazione viene aggiunto uno dei quattro nucleotidi "modificati" (ddATP nella prima, ddCTP nella seconda, ddGTP nella terza, ddTTP nella quarta).
Perciò quello che succede in ogni reazione è che durante la replicazione del DNA, in maniera casuale, ogni tanto viene incorporato il nucleotide modificato, interrompendo la reazione.
Quindi, ad esempio, nella reazione contenente ddATP otteniamo:
filamento stampo
CCGTTAGCTAGAATTTCGATTAGCT
filamenti nascenti (complementari a quello stampo)
GGCA --> interrotto alla prima T
GGCAA --> interrotto alla seconda T
GGCAATCGA --> interrotto alla terza T
e così via.
Ottieni quindi frammenti di DNA di lunghezza diversa, tutti interrotti con una Adenina (ddATP, modificata), e così per ognuna delle 4 reazioni allestite, solo che ognuna avrà frammenti che terminano con un nucleotide diverso.
A questo punto i frammenti di DNA ottenuti da ciascuna reazione vengono fatti correre in un gel e separati in base alla lunghezza (proporzionale al peso molecolare) mediante la tecnica dell'elettroforesi.
Si ottengono 4 colonne corrispondenti ai frammenti delle 4 reazioni; ogni frammenti occupa un'altezza diversa sul gel che corrisponde alla sua lunghezza. Dall'ordine con cui si alternano i frammenti provenienti da ciascuna delle 4 reazioni si ottiene la sequenza nucleotidica del DNA sequenziato.
Guarda il disegno che ho caricato e se ancora hai dei dubbi, prova a fare una domanda più specifica e io cercherò di aiutarti :)
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